DNA-Computing
DNA-Database
ПЦР метод
В заключении надо отметить, что ДНК компьютер имеет некоторые очевидные недостатки: большая сложность и дороговизна нано-конструкции какого компьютера. К тому же при увеличении сложности консрукции будет увеличиваться частота ошибок, поломок. Например, попробуйте разместить сотню молекул в одном месте - их неизбежно начнет разносить в стороны в результате теплового (броуновского) движения. Поэтому, до создания первого ДНК - процессора еще далеко.
Принцип метода полимеразной цепной
реакции (ПЦР)(Polymerase chain reaction (PCR)) был разработан Кэри Мюллисом
(фирма “Cetus”, США) в 1983г. и в настоящее время широко используется как
для научных исследований, так и для диагностики в практическом здравоохранении
и службе госсанэпиднадзора (генотипирование, диагностика инфекционных заболеваний).
В основе метода ПЦР лежит комплементарное
достраивание ДНК матрицы, осуществляемое in vitrо с помощью фермента ДНК-полимеразы.
Эта реакция носит название репликации ДНК. Естественная репликация ДНК
включает в себя несколько стадий:
1) Денатурация ДНК (расплетение двойной
спирали, расхождение нитей ДНК);
2) Образование коротких двухцепочечных
участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК);
3) Синтез новой цепи ДНК (комплементарное
достраивание обеих нитей)
Открытие термостабильной ДНК-полимеразы
(Taq-полимеразы) из термофильных бактерий Thermis aquaticus , оптимум работы
которой находится в области 70-72оС, позволило сделать процесс репликации
ДНК циклическим. При многократном повторении циклов синтеза происходит
экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента ДНК, что
позволяет из небольшого количества анализируемого материала , который может
содержать единичные клетки микроорганизмов получить достаточное количество
ДНК копий для идентификации их методом электрофореза.
Комплементарное достраивание цепи начинается
не в любой точке последовательности ДНК, а только в определеннных стартовых
блоках- коротких двунитевых участках. При присоединении таких блоков к
специфическим участкам ДНК можно направить процесс синтеза новой цепи только
в этом участке, а не по всей длине ДНК цепи. Для создания стартовых блоков
в заданных участках ДНК используют две олигонуклеотидные затравки(20 нуклеотидных
пар), называемые праймерами. Праймеры комплементарны последовательностям
ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы
таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними.
Таким образом, метод ПЦР представляет
собой многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического
участка ДНК катализируемое ферментом ДНК- полимеразой.
Каждый цикл амплификации включает 3 этапа,
протекающих в различных температурных режимах
1 этап: Денатурация ДНК (расплетение двойной
спирали). Протекает при 93-95о в течение 30-40 сек.
2 этап: Присоединение праймеров (отжиг).
Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям
на противоположных цепях ДНК на границах специфического участка. Для каждой
пары праймеров существет своя температура отжига, значения которой располагаются
в интервале 50- 65оС. Время отжига -20-60 сек.
3 этап: Достраивание цепей ДНК. Комплементарное
достраивание цепей ДНК происходит от 5’-конца к 3’-концу цепи в противоположных
направлениях, начиная с участков присоединения праймеров.
Материалом для синтеза новых цепей ДНК
служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (дНТФ). Процесс
синтеза катализируется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой (Taq-полимеразой)
и проходит при температуре 70-72оС. Время протекания синтеза - 20-40 сек.
Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами
для второго цикла амплификации, в котором происходит образование искомого
специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации
ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом происходит
накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n-число циклов амлификации
. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась только
одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается
около 108 молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной
визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле.
Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате
(амплификаторе), который по заданной программе автоматчески осуществляет
смену температур согласно числу циклов амплификации.
Преимущества метода ПЦР как метода диагностики инфекционных заболеваний
Прямое определение наличия возбудителей
Многие традиционные методы диагностики,
например иммуноферментный анализ, выявляют белки-маркеры, являющиеся прдуктами
жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство
наличия инфекции. Выявление специфического участка ДНК возбудителя методом
ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.
Высокая специфичность
Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена
тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только
для данного возбудителя фрагмент ДНК. Специфичность задается нуклеотидной
последовательностью праймеров, что исключает возможность получения ложных
результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки
ошибки в связи с перекрестно-реагирующими антигенами.
Высокая чувствительность
Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные
клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей
инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими,
бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Чувствительность
ПЦР-анализа составляет 10- 1000 клеток в пробе (чувствительность иммунологических
и микроскопических тестов - 103- 105 клеток).
Универсальность процедуры выявления различных
возбудителей
Материалом для исследования методом ПЦР
служит ДНК возбудителя. Метод основан на выявлении фрагмента ДНК или РНК,
являющегося специфичным для конкретного организма. Сходство химического
состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы
проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагносцировать
несколько возбудителей из одной биопробы.В качестве исследуемого материала
могут использоваться различные биологические выделения (слизь, моча, мокрота),
соскобы эпителиальных клеток, кровь, сыворотка.
Высокая скорость полученоя результата анализа
Для проведения ПЦР-анализа не требуется
выделение и выращивание культуры возбудителя, что занимает большое количество
времени. Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов
реакции,и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести
полный анализ за 4-4.5 часа.
Возможность диагностики не только острых,
но и латентных инфекций
Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики
трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов,
с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях,
поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием
таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики
также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью
и внутриклеточных паразитов.
Следует отметить, что методом ПЦР возможно
выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от
больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода,
почва и т.д.)
